(一)細(xì)胞凍存

　　1. 配置含10%DMSO或凡士林、10～20%小牛血清的凍存細(xì)胞培養(yǎng)液;2. 取對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期的體細(xì)胞，除去舊細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清理。

　　3. 除去PBS，添加適量蛋白酶(遮蓋細(xì)胞培養(yǎng)皿表層)把單面生長(zhǎng)發(fā)育的體細(xì)胞消化吸收出來(lái);4. 抽濾1000rpm，5min;5. 除去蛋白酶，添加適量配置好的凍存細(xì)胞培養(yǎng)液，用塑料吸管輕輕地吹打使體細(xì)胞勻稱，記數(shù)，調(diào)整凍存液中體細(xì)胞的最后相對(duì)密度為5牙周106/ml～1牙周107/ml;6. 將體細(xì)胞分裝進(jìn)凍存管中，每管1～1.5 ml;7. 在凍存管上標(biāo)出體細(xì)胞的名字，凍存時(shí)間及作業(yè)者;8. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序流程為減溫速度-1～-2℃/min;當(dāng)溫度達(dá)-25℃下列時(shí)，可升至-5℃～-10℃/min;到-100℃時(shí)，則可快速滲入液態(tài)氮中。也可將配有體細(xì)胞的凍存管放進(jìn)-20℃電冰箱2h，隨后放進(jìn)-70℃電冰箱中留宿，取下凍存管，移進(jìn)液氮容器內(nèi)。

　　(二) 細(xì)胞復(fù)蘇

　　1. 從液氮容器中取下凍存管，立即滲入37℃溫開水中，并時(shí)常搖晃令其盡早溶化。

　　2. 從37℃水浴中取下凍存管，開啟外蓋，用塑料吸管吸出來(lái)體細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上細(xì)胞培養(yǎng)液，攪拌;3. 抽濾， 1000rpm，5min;4. 棄去上清液，添加含10%小牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液重懸體細(xì)胞，記數(shù)，調(diào)節(jié)體細(xì)胞相對(duì)密度，打疫苗塑造瓶，37℃恒溫箱靜放塑造;5. 隔日拆換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，再次塑造。

　　常見問(wèn)題

　　1.從繁衍期到產(chǎn)生高密度的單層細(xì)胞之前的塑造體細(xì)胞都能夠用以凍存，但最好是為多數(shù)成長(zhǎng)期體細(xì)胞。在凍存前一天最好是換一次細(xì)胞培養(yǎng)液;2.將凍存管放進(jìn)液氮容器或從這當(dāng)中取下時(shí)，要搞好安全防護(hù)工作中，以防凍傷;3.凍存和再生最好用新配置的細(xì)胞培養(yǎng)液。

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